Но, как и в случае амакриновых клеток, имелись весомые основания подозревать, что это далеко не все разновидности биполярных клеток, которые существуют в сетчатке. В середине 1990-х гг. исследованием биполярных клеток занимались четыре – пять лабораторий, и по их оценкам количество типов таких клеток варьировалось от четырех до девяти. Мы с моей лабораторией присоединились к этой работе довольно поздно с тайной надеждой на то, что накопленная другими база знаний позволит нам понять организацию биполярных клеток. Но, как оказалось, эта база знаний включала в себя слишком много несистематических данных в духе коллекционирования бабочек: небольшая выборка клеток здесь, небольшая выборка там. Поэтому наш набор вопросов был совершенно иным. Во-первых, существуют ли типы биполярных клеток, которые не удалось обнаружить с помощью ранее использованных методов окрашивания? Во-вторых, существует ли среди биполярных клеток разделение на основные, доминирующие группы и малочисленные группы вспомогательных клеток? Или же все типы биполярных клеток более-менее равны?
Чтобы ответить на вопрос, мы объединились с Элио Равиолой. Некоторое время назад он провел потрясающую серию экспериментов с окрашиванием клеток сетчатки, но эти снимки пылились в нижнем ящике его рабочего стола[15]. Один из его студентов провел предварительный анализ, но Элио решил не продолжать работу, потому что, будучи перфекционистом, остро осознавал несовершенство оборудования. В частности, он считал, что ему удалось окрасить далеко не все биполярные клетки.
У нашей лаборатории имелось два важных преимущества. Во-первых, метод фотозаполнения, который позволял получить надежную и всеобъемлющую выборку биполярных клеток. Во-вторых, у нас была Маргарет Макнил, которая к тому времени стала мастером трехмерной визуализации нейронов. Сделанные ею снимки были нашей тайной гордостью. Мы, нейроанатомы, любим красивые фотографии нейронов – нам кажется, что в них кроется что-то мистическое, открывающаяся нашему взору частица Истины.
Наконец, у нас имелся еще один ценнейший набор данных для идентификации клеток: снимки биполярных клеток, в которые были микроинъектированы маркерные молекулы после того, как были изучены их электрические ответы. Эта работа была проделана нашим другом Рэем Дашё из Алабамского университета. Знание того, как клетки реагируют на свет, было важным дополнением, поскольку реакции клеток оказались такими же разнообразными и характерными, как и их формы. Каждый из трех методов – окрашивание, фотозаполнение и микроинъекции – имел свою специфику, и мы надеялись, что ни одному типу клеток не удастся ускользнуть от всех трех детекторов. Итак, объединив все три вида данных, мы с уверенностью пришли к выводу, что существует целых 13 типов биполярных клеток. Вот они, нарисованные рукой Элио:
Этот рисунок подчеркивает определяющую особенность форм биполярных клеток – глубину их аксонных деревьев. Как и другие лаборатории, мы обнаружили, что главная отличительная черта биполярных клеток – конкретный уровень в синаптическом слое сетчатки, на котором разветвляются их аксоны. Как вы видели на рисунке амакриновых клеток, глубина погружения во внутренний синаптический слой сетчатки влияет на то, с какими типами других игроков – амакриновых и ганглионарных клеток – контактирует эта конкретная биполярная клетка.
Мы также обнаружили, что не существует какого-либо основного, преобладающего типа биполярных клеток. Как и амакриновые клетки, биполяры оказались более-менее равномерно разделены на несколько разных групп. Это означало, что сетчатка имеет примерно 13 параллельных путей от фоторецепторных клеток к внутреннему слою, где они подходят к примерно 29 типам амакриновых клеток и далее идут к, предположительно, еще большему числу типов ганглионарных клеток, которые окончательно кодируют визуальное сообщение и передают его в головной мозг.
Некоторое время спустя, когда были изобретены более совершенные красители, группа Хайнца Вессле провела исследование по идентификации биполярных клеток. Продемонстрировав высший пилотаж в технике иммуноокрашивания, они получили настолько однозначные и детальные данные, что суммирование количества отдельных типов клеток в точности дало общее число биполярных клеток сетчатки (установленное нами с Энрикой). Вессле и его коллеги пришли к выводу, что «все основные типы биполярных клеток сетчатки мыши идентифицированы и каталог из 11 типов колбочковых биполярных клеток и одного типа палочковых биполярных клеток можно считать полным»[16]. Новые исследования, проведенные с использованием самых современных техник электронной микроскопии и мощных молекулярно-генетических маркеров, внесли лишь незначительные изменения и дополнения в каталоги биполярных клеток, составленные Макнил и лабораторией Вессле. Общее количество идентифицированных типов варьируется от 12 до 15 в зависимости от используемых критериев.
Биполярные клетки составляют основу сетчатки. Дюжина типов биполяров представляют собой «примитивы» зрения. На более поздних этапах эволюции сетчатки и мозга сигналы, генерируемые биполярными клетками, стали собираться в различные комбинации, модифицироваться, усиливаться или игнорироваться. Но ни сетчатка, ни мозг не могут выйти за пределы ограничений, установленных биполярными клетками как базовыми элементами зрительного восприятия.
Самым влиятельным исследователем сетчатки в конце XX в. был Брайан Бойкотт, член Королевского общества без ученой степени.
Впервые я встретился с ним в его лаборатории в Королевском колледже на Друри-лейн в Лондоне[17]. Это было пыльное, необжитое на вид помещение с деревянными шкафами, забитыми старыми лабораторными журналами и оборудованием. Бойкотт тогда уже был знаменитым ученым. Он возглавлял отделение биофизики в Королевском колледже Лондона, где в свое время никому не известная Розалинда Франклин получила необычайно четкие дифракционные рентгенограммы ДНК, благодаря которым будущие нобелевские лауреаты Уотсон и Крик смогли сделать важные открытия, касающиеся структуры ДНК. Бойкотт носил простую рубашку без галстука и старомодные брюки, над которыми нависало брюшко. Он курил сигареты без фильтра. Я был нервным, амбициозным молодым ученым, только начинавшим приобретать известность за пределами своего университета. Мы сидели лицом к лицу на лабораторных табуретах. Брайан без тени снисходительности или скептицизма расспрашивал меня о моих экспериментах, новости о которых доходили до него по сарафанному радио. Мы проговорили до конца рабочего дня. Это была наша первая из длинной череды столь же затяжных, сопровождавшихся бесконечным курением бесед.
Брайан Бойкотт родился в городке Кройдон, Англия, зимой 1924 г. Когда ему исполнилось семь лет, мать вместе с ним сбежала от мужа-алкоголика. Так в разгар Великой депрессии они остались без финансовой поддержки. Несколько месяцев они жили у друзей, пока матери в конце концов не удалось найти низкооплачиваемую работу и снять комнату.
К счастью, непутевый отец Брайана некогда был франкмасоном, что дало мальчику право на поступление в одну из масонских школ. Это была школа-интернат классического британского образца, где учеников обеспечивали жильем, питанием и даже одеждой. Начиная с восьми лет все детство и юность с перерывом на короткие каникулы Брайан провел в масонской школе.
Хотя трудности Брайана далеко не исчерпывались стандартным набором детских болезней, он не чувствовал себя несчастным в школе-интернате. Его успехи в учебе были невелики. Выпускные экзамены по французскому и математике Брайан провалил, по химии и физике едва наскреб на «удовлетворительно». Отвергнутый Кембриджским университетом, он поступил в Бербек-колледж, филиал Лондонского университета с вечерним обучением, где «народ из рабочего класса по вечерам получал высшее образование». Но вскоре разразилась Вторая мировая война; во время «Лондонского блица» в здание Бербек-колледжа попала зажигательная бомба, поэтому занятия проводились в помещениях уцелевшего первого этажа, которые сверху покрыли обычным гофрированным железом. Студентов дневного отделения Лондонского университета эвакуировали в Северный Уэльс, где они продолжили учебу в комфорте и безопасности, тогда как Бойкотту и его сокурсникам пришлось получать знания под жестяной крышей, которая летом раскалялась под солнцем и оглушительно грохотала под дождем.
Чтобы зарабатывать себе на жизнь, Бойкотт устроился техником в виварий Национального института медицинских исследований, где в его обязанности наряду с прочим входила чистка клеток. Вероятно, он хорошо зарекомендовал себя на этой грязной работе, потому что вскоре ему предложили более интересную должность лаборанта в физиологической лаборатории.
До предыдущего года эта лаборатория была вотчиной сэра Генри Дейла, пионера синаптической биологии, и сохранила заведенные им порядки и дисциплину. Бойкотт проработал там четыре года, по вечерам изучая биологию в колледже. Для начинающего биолога это был фантастический опыт. В виварии он работал плечом к плечу с людьми из рабочего класса, которых уважал и любил. В лаборатории Дейла – с представителями научной элиты. В те времена исследовательские группы были небольшими, и даже у знаменитого на весь мир Дейла группа насчитывала не больше 15 исследователей и лаборантов. По-видимому, даровитый молодой лаборант стал всеобщим любимцем, потому что вскоре ему разрешили самостоятельно проводить эксперименты. Один из таких экспериментов состоял в том, что собак ставили на качающуюся платформу и держали их там, пока у них не начиналась рвота. Это исследование было заказано Королевскими военно-воздушными силами, которые хотели узнать биологическую подоплеку морской болезни. Брайан рассказал мне историю об одной умной собаке, которую начинало тошнить при одном виде платформы, из-за чего в тот день она становилась непригодной для эксперимента. Возможно, именно поэтому нейробиологические основы павловского условного рефлекса всегда вызывали у Бойкотта живой интерес.
Позже он писал о большом значении этого этапа его жизни, когда он сформировал свои исследовательские интересы, сдружился с широким кругом ученых и даже написал первую научную статью. В ней был представлен новый метод измерения количества углекислого газа, накапливаемого в ребризере – подводном дыхательном аппарате с повторным использованием выдыхаемого воздуха. Хотя война к тому времени подошла к концу, к сожалению, военные поставили на статье гриф «секретно» и запретили ее публиковать.
Как бы то ни было, Бойкотт приобрел некоторую известность в научных кругах, и после окончания Бербек-колледжа ему предложили место младшего преподавателя на факультете зоологии в Университетском колледже. Он преподавал студентам лабораторный раздел вводного курса (сейчас эту черную работу обычно возлагают на ассистентов кафедры или аспирантов). Он также записался в аспирантуру, но отложил работу над диссертацией, когда получил предложение войти в исследовательскую группу зоолога с мировым именем Дж. З. Янга, работавшего в лаборатории морской биологии в итальянском Неаполе. Море было щедрым источником животных, на которых зоологи могли изучать общие принципы, а Бойкотта, в частности, интересовало, можно ли узнать что-то новое о механизме обучения, используя мозг осьминога.
Проведенное группой Янга исследование нейронных основ обучения вызвало своего рода ажиотаж. О нем много писали не только в различных научных журналах, но и в популярной прессе (еще бы, осьминоги способны учиться!). К сожалению, звездного босса Брайана больше заботила публикация очередной статьи, чем диссертация его сотрудника. В результате Бойкотт так и не написал диссертацию, хотя к тому времени уже заработал себе солидную научную репутацию. Британское научное ведомство решило, что докторская степень не так уж важна для настоящего ученого, и повысило Бойкотта до профессорского звания. Впоследствии он с гордостью поправлял каждого, кто называл его доктором Бойкоттом, – мол, он «просто профессор Бойкотт».
По возвращению из Неаполя в Великобританию ученый заинтересовался другими темами, связанными с обучением, в частности изменениями, которые происходят в мозге у представителей семейства беличьих, когда те впадают в спячку. Отчасти по этой причине он на один семестр отправился преподавать в Гарвард, где найти этих пушистых грызунов для опытов было куда легче, чем в Лондоне.
В Гарварде он познакомился с Джоном Даулингом, и партнерство между ними привело к важному достижению. На тот момент Даулинг как раз занялся изучением сетчатки млекопитающих с помощью электронной микроскопии. Но электронная микроскопия дает слишком большое увеличение. В результате Даулинг обнаружил в сетчатке любопытную организацию синаптических связей, но из-за чрезмерно увеличенного изображения никак не мог понять, каким клеткам они принадлежат. Бойкотт был мастером окрашивания целых клеток и, изучая осьминогов, научился искусно распутывать нейронные сети. Бойкотт и Даулинг быстро осознали, что прекрасно дополняют друг друга. Вместе они провели фундаментальное исследование нейронных связей в сетчатке, которое заложило основу для ее понимания.