Ответ обнадеживал разве что своей четкостью. Как вы помните, целью всего этого начинания, заставлявшей нас считать нейроны до поздней ночи, было понять, как сетчатка обрабатывает информацию: каким образом она формирует сообщения, отправляемые ганглионарными клетками в мозг? Другими словами, как cетчатка запускает первый этап зрительного восприятия? Мы оказались в тупике: 76 % потенциальных входов в ганглионарные клетки оставались для нас невидимыми.
Энрика Стреттои – директор по исследованиям в Институте нейронаук Национального исследовательского совета Италии. Эта невысокая женщина пленяет своей жизнерадостностью и изысканным стилем. Большую часть времени она ходит на каблуках, и даже если изредка является в лабораторию в джинсах, в ее наряде всегда есть что-то креативное – обычные футболки не для Энрики. В моей памяти навсегда запечатлелась картина: Энрика идет по многолюдной улице в Пизе в разгар лета, на ней элегантный белый льняной пиджак, такая же юбка и жемчужные украшения, ее высокие каблуки легко цокают по неровной брусчатке.
Она родилась, выросла и живет в Пизе – городе, где был основан один из первых университетов средневековой Европы. В детстве она жила на втором этаже над продуктовым магазином, который держала ее мать. Сейчас они с мужем Лукой живут в пригороде в добротном фермерском доме, окруженном прекрасным садом. У них двое дочерей: одна стала врачом, другая учится на врача. В отличие от своей темпераментной матери, ее дочери – спокойные и тихие девушки, по крайней мере когда говорят по-английски.
Энрика – трудоголик. Как настоящая итальянка, по выходным она любит готовить для семьи вкусные блюда, но в рабочие дни приезжает в лабораторию первой и уезжает последней. Она не любит дураков, но вежливо их терпит. График жизни у Энрики такой: на много месяцев уйти с головой в работу, в августе как следует отдохнуть с семьей на море или в итальянских Альпах, а Рождество встретить дома в Пизе. Энрика – набожная католичка. Кроме того, они с Лукой увлекаются пением и поют в местной оперной труппе. Свои электронные письма друзьям она подписывает: «Крепко обнимаю, Энрика».
Один из ее проектов направлен на поиск способов противодействовать развитию слепоты, которая вызывается распространенной группой наследственных заболеваний, в совокупности известных как пигментный ретинит. Причина этих заболеваний в дефектных генах, экспрессируемых в фоторецепторах сетчатки. У человека, унаследовавшего один из таких генов, происходит дегенерация фоторецепторов, и человек теряет зрение – иногда за несколько лет после рождения, иногда за несколько десятилетий.
Энрика задалась вопросом, не может ли сенсорный ввод влиять на течение дегенеративного процесса. Вместе со своими учениками она решила проверить эту гипотезу на мышах с такими же мутациями фоторецепторных генов. Они вырастили одну группу таких мышей в обычных скучных клетках, а экспериментальную группу – в клетках, полных «игрушек» – деревянных блоков, по которым можно было лазить, норок, где можно было прятаться, и колес для бега. К своему удивлению, ученые обнаружили, что сетчатки мышей в такой обогащенной среде деградировали гораздо медленнее. Дальнейшие эксперименты показали, что основной положительный эффект дает беговое колесо – точнее говоря, физическая активность – в сочетании с сенсорной стимуляцией[14].
Как именно это работает, до сих пор неясно, и результаты исследований Энрики не вызвали у научного сообщества большого интереса. В том, что физическая активность полезна, нет ничего нового; все знают, что это – «чудодейственное лекарство», способное замедлить и даже полностью предотвратить развитие практически любых заболеваний от головы до пят. Поскольку исследования Энрики всегда отвечают высочайшим научным стандартам, я убежден, что им можно доверять. И я считаю, что пациенты, страдающие пигментным ретинитом, должны знать, что с помощью физических упражнений они могут замедлить дегенеративный процесс в своей сетчатке. Поверьте, если бы я начал слепнуть от такого заболевания, я бы не ленился дважды в день потеть на беговой дорожке.
Так как же нам установить идентичности этих 76 % таинственных амакриновых клеток? Мы перепробовали весь каталог потенциальных иммунохимических маркеров, но это не дало нам ничего нового. Нам нужно было найти новый подход к изучению нейронов сетчатки, который позволил бы идентифицировать
Прежде всего мы решили сосредоточиться не на молекулярном окрашивании, а на форме клеток. Причудливые паттерны ветвления нейрональных дендритов и аксонов зачаровывали нейробиологов с момента рождения дисциплины. Некоторое время назад в Массачусетском технологическом институте состоялась
На рисунке выше показаны три нейрона сетчатки A, В и С – это вид сбоку, как на поперечном срезе сетчатки. Нейроны A и С – амакриновые клетки, которые протягивают свои отростки только во внутренний слой сетчатки в направлении к ганглионарным клеткам. Обратите внимание, что их дендриты доходят до разных уровней внутреннего синаптического слоя. Это очень важно. Амакриновая клетка С не может образовывать синаптический контакт с ганглионарной клеткой B, потому что их отростки находятся на разных уровнях и не касаются друг друга.
Вторая важная вещь, на которую следовало обратить внимание, – насколько далеко простираются нервные отростки. Амакриновые клетки A и C не могут выполнять одинаковую функцию из-за их разной формы, то есть они должны относиться к разным типам клеток. A – маленькая клетка, C – большая. Как вы помните, горизонтальная протяженность отростков нейрона сетчатки определяет размер его рецептивного поля. Клетки с далеко ветвящимися отростками отвечают за восприятие большой области видимого мира; клетки с короткими отростками – маленькой области. Таким образом, амакриновые клетки А и C выполняют разные зрительные функции, отправляют ганглионарной клетке разные виды сигналов и, следовательно, вносят разный вклад в формирование визуального сообщения, которое ганглионарная клетка передает в мозг.
Вопрос был в том, каким образом в настоящей сетчатке можно увидеть полные формы клеток со всеми их отростками, как это показано на рисунке на предыдущей странице? Тело клетки увидеть довольно легко – это основа клетки, хранилище, где находится ее ДНК и органеллы, отвечающие за производство энергии и поддержание клеточной жизнедеятельности. Но отростки нейрона – аксон и дендриты – почти невидимы: они очень тонкие и тесно переплетены с отростками других нейронов. Даже если бы существовал краситель, способный полностью окрасить дендриты до самых кончиков, идентифицировать все дендриты индивидуального нейрона было бы практически невозможно.
Нам требовалось найти такой метод, который позволил бы нам надежно выделять отдельный нейрон среди всех остальных. Кроме того, метод должен был быть управляемым, чтобы мы могли использовать его для систематической выборки популяций амакриновых клеток. Техника, на которой мы в итоге остановились, называлась фотозаполнением (
Трудностей, разумеется, хватало. Например, флуоресцентную клетку нельзя было фотографировать обычным способом, потому что используемый в этом случае свет вызывал реакцию флуоресценции во всех окружающих клетках. Мы решили эту проблему, купив самый высокочувствительный (и астрономически дорогой) цифровой фотоаппарат, позволяющий делать снимки менее чем за одну десятую долю секунды – прежде чем флуоресцентная реакция успевала распространиться вокруг. Также выяснилось, что этот метод работал лучше с маленькими клетками, чем с большими. Как бы то ни было, по мере практики наш оператор Маргарет Макнил, опытный постдок, овладела этой техникой почти в совершенстве. Когда она нацеливала луч света на случайно выбранную клетку, ей удавалось зафиксировать изображение ее дендритного дерева в 94 % случаев. Несколько сотен таких фотографий обеспечили нам довольно-таки репрезентативную выборку всей популяции амакриновых клеток.
Помните вопрос, с которого мы начали это исследование? Если 24 % всех амакриновых клеток, которые мы идентифицировали, относятся к специфическим редким типам таких клеток, то каковы тогда обычные амакриновые клетки? К нашему большому удивлению, ответ заключался в том, что обычных амакриновых клеток
Что это значит? Мы ожидали обнаружить среди амакриновых клеток несколько основных крупных групп, дополненных малочисленными группами специализированных клеток. Но вместо этого оказалось, что амакриновые клетки довольно равномерно распределены среди разнообразного набора клеточных типов. А это предполагало, что все они играют одинаково важную роль в обработке визуальной информации. Наш вывод, который мы (с небольшими трудностями) опубликовали в ведущем научном журнале, заключался в том, что в сетчатке существует 29 различных типов амакриновых клеток, каждый из которых выполняет свою специфическую функцию по обработке визуального изображения.
Почему это короткое заключение заслуживает особого внимания? Оказалось, в нем крылся важный ключ к разгадке того, как работает сетчатка. Зачем сетчатке нужны целых 29 типов амакриновых клеток? Ответ напрашивался сам собой: в сетчатке происходит гораздо больше обработки информации, чем считалось раньше. Амакриновые клетки генерируют основной выход для ганглионарных клеток, которые являются последним звеном цепи перед отправкой зрительных сообщений в головной мозг. Если амакриновые клетки так разнообразны, значит, сообщения должны быть такими же разнообразными. Это был важный шаг вперед к пониманию того, как работает зрительное восприятие.
Пока мы занимались амакриновыми клетками, наши коллеги изучали другие компоненты микросхемы сетчатки. Главным пробелом в нашей базе знаний были биполярные клетки. Как вы помните, биполярная клетка получает синаптический вход от нескольких фоторецепторных клеток и передает выходной сигнал через амакриновую клетку в ганглионарную. Биполяры являются важнейшим элементом сетчатки. Если удалить из сетчатки все амакриновые клетки, после некоторой перестройки она все равно сможет функционировать благодаря ганглионарным клеткам с транзиторным и устойчивым ответами, хотя изображение будет не таким контрастным и пропадет избирательность в отношении направления. Другими словами, человек без амакриновых клеток все равно будет видеть, но его зрение окажется расплывчатым и замедленным. Если убрать биполярные клетки, сетчатка сможет сообщать мозгу только о наступлении дня и ночи благодаря примитивной функции, выполняемой подгруппой органически светочувствительных ганглионарных клеток.
Все вы слышали о научных прорывах, когда новое открытие или идея внезапно, подобно молнии среди ясного неба, меняли целые области науки. Но гораздо чаще наука движется вперед путем постепенного приращения: по мере накопления данных возможность превращается в вероятность, которая в конце концов трансформируется в факт. Так было и в случае с нашим пониманием биполярных клеток.
Первые системные исследования с регистрацией электрической активности биполярных клеток, проведенные Акимити Канеко, Фрэнком Верблином и Джоном Даулингом, показали существование четырех типов клеток: с транзиторными on– и off-ответами и устойчивыми on– и off-ответами. Казалось логичным предположить, что эти четыре физических типа биполярных клеток соответствуют четырем аналогичным типам ганглионарных клеток.