С самого начала Северной войны украинские войска приняли в ней активное участие. В боях под Нарвой 1700 г. погиб наказной гетман. племянник Мазепы И. Обидовский.
Лучшая европейская армия оказалась крайне сложным противником для казаков, потребовавшим перестройки полков, введения мун-штры. назначения иностранных командиров и т. д. Служба была очень тяжелой, фуража и продовольствия не было, в псковской земле казаков, добывавших провиант и корма, избивали. Сразу же начались конфликты гетманских офицеров и казаков с российским командованием, побеги, неудовольствие.
Весной 1701 г. казаки выступили в Лифляндию. В сражении при Эрестферской мызе был разбит шведский генерал Шлиппенбах, взят Юрьев (Тарту). Казаки получили большую добыч, но ее у них отбирали русские офицеры. Это вызывало новое недовольство службой, а также — гетманом. В конце второго года войны массовые выступления казаков приобретали уже весьма угрожающий характер. К тому же подняли бунт запорожцы, заключившие союз с Крымом.
В июле 1703 г. казаки были отправлены в Белоруссию к Быхову и Могилеву, чтобы не дать польским сторонникам шведов укрепиться в них. К Быхову прибыл отряд Стародубского полковника Миклашевского с 12 000 казаков. Осада прошла удачно, и 12 октября комендант сдался.
Вначале 1704 г. Самусь и Искра перешли на Левобережье и отдали свои гетманские клейноды Мазепе. Раскол в Речи Посполитой между сторонниками Августа и Лещинского создавали удобный повод для военного вмешательства.
В начале мая 1704 г. по указу Петра гетман со своими полками (тремя городовыми и одним охочим) переправился через Днепр и вступил в пределы Правобережья. Палий был арестован, а затем сослан в Сибирь. Его казаки признали власть Мазепы, и Украинское гетманство вновь объединилось.
Имея согласие Петра и пользуясь катастрофическим положением Августа II. Мазепа в короткий период восстановил на Правобережье полковую организацию (Белоцерковский, Корсунский, Чигиринский, Уманский, Брацлавский, Черкасский, Каневский и Богуславский полки). Там были введены аренды, которые приносили ощутимый доход. Кроме того, Мазепа заселил территории («от Киеве далей до Богу и до Днестра»), которые, согласно Вечному миру, должны были оставаться пустующими. Всего (по русским данным) с Левого берега было переселено 50 тысяч человек.
По указу Петра, в 1705 г. Мазепа должен был выслать три тысячи казаков к Полоцку на соединение с русской армией, а сам с 30 тысячами перейти Днепр и вступить в Польшу «прошлогодним путем». Владения сторонников Лещинского предписывалось разорять всеми мерами. Чуть позже маршрут движения гетмана был уточнен: на Львов, а затем к Сандомиру, «поспешая». Повторив путь Б. Хмельницкого, казаки во главе с Мазепой в ноябре 1705 г. вынудили сдаться Замостье.
В середине февраля 1706 г. Мазепа выступил со своим войском (14 000 человек) из Дубно в Литву и в марте был уже в Минске. Ему было приказано совершать рейды против шведских войск. Для этой цели в Несвиже был поставлен отряд Стародубского полковника М. Миклашевского, а в Ляховичах — Переяславского И. Мировича. Шведы ночью напали на Несвиж и перебили сонных казаков. Миклашевский погиб. Почти одновременно в середине марта в Ляховичах был осажден Мирович и вскоре был вынужден сдаться. Мирович так и погиб в плену. Гибель двух известных полковников болью отозвалась в Украине.
После этих событий. Петр все чаще использует казаков на фортификационных работах, в частности — при строительстве Печерской крепости.
В условиях Северной войны Петр начинает осуществление реформ, направленных на создание Российской империи и одновременно ведших к ограничению украинской автономии. В 1707 г. параллельно начали осуществляться четыре проекта-реформы: ведомственная реформа (перевод Малороссийского приказа в Розряд), областная реформа (создание губерний), создание из казаков "компаний” и передача военных крепостей в управление русскими.
Согласно первой реформе, украинские города Киев, Чернигов, Нежин, Переяславль и др. переводились из ведома Малороссийского приказа, являвшегося частью Посольского приказа, в Разряд, что означало начало превращения Украины из “иностранного”, т. е. автономного, государства в обычную провинцию России. Должность Белгородского воеводы заменялась воеводой Киевским. Эта реформа положила конец существованию старого Малороссийского приказа и подготовила почву для создания Малороссийской коллегии — нового образования на совершенно иной концептуальной основе.
В рамках областной всероссийской реформы была образована Киевская губерния, при составлении границ которой старые административные границы Украинского гетманства вообще не учитывались.
В тот же период Петром было инициировано создание «кумпаний», в которые должны были попасть только каждый пятый из реестровых казаков. Украинское войско давно уже требовало реформы. Боеспособность охотницких полков только лишний раз доказывала это, но нарушение принципа формирования казацких полков сразу же затрагивало всю административную систему Украинского гетманства, в основе которой лежал полковой принцип.
Наконец, в 1707 г. Петр передал в управление киевского воеводы Д. М. Голицына пограничные крепости, находившиеся до этого в подчинении гетмана.
Реформы вызывали резкую оппозицию со стороны старшин, выступавших против сокращения автономии Украинского гетманства. В условиях начавшихся бунтов, вызванных тягостями Северной войны, Мазепа весной 1707 г. начал тайные переговоры со ставленником шведского короля С. Лещинским. Хотя они и носили осведомительный характер, В. Кочубей написал на гетмана донос. Петр не поверил Кочубею, и разрешил его казнить.
Между тем тайная капитуляция Августа II шведам и его отказ от короны поставил Петра в крайне сложное положение. На переговорах с поляками он был готов уступить Правобережную Украину". Кроме того, российским командованием была принята доктрина «выжженной земли», т. е. уничтожения всех запасов и эвакуации жителей. Под этот план попадала Белоруссия и значительная территория Украинского гетманства. В условиях начала украинского похода Карла XII и поступлении приказа о введении в Стародубском полку плана «выжженной земли», Мазепа с генеральной старшиной, полковниками и частью войск перешел на сторону шведского короля.