Результаты эксперимента Джесин[35] были потрясающими. Она добилась того, что точная репарация мутировавшего гена посредством гомологичной рекомбинации прошла в целых 10 % клеток; сейчас эта эффективность может показаться не слишком высокой, однако это было в сотни раз лучше, чем у лучших из достигнутых к тому времени результатов. На тот момент это было наиболее многообещающее свидетельство того, что гомологичная рекомбинация может рано или поздно позволить ученым переписывать генетический код без риска незаконной рекомбинации или риска случайного встраивания в геном различных последовательностей при использовании ретровирусных векторов. Стоит лишь инициировать двуцепочечный разрыв в нужном месте – и фактически все остальное клетки сделают сами.

Имелась только одна проблема: чтобы этот подход можно было практически использовать, нужно было научиться разрезать геном в строго заданных местах. В эксперименте Джесин для проверки правильности идеи последовательность, которую распознавала эндонуклеаза I-SceI, была искусственно добавлена в геном перед введением нуклеазы, однако последовательности многих болезнетворных генов, скажем так, незыблемы: их невозможно изменить таким образом, чтобы они “пришлись по вкусу” тому или иному придирчивому ферменту. После разрыва геном легко восстанавливался и включал в себя новую генетическую информацию – хитрость была в том, чтобы понять, как сделать разрыв в нужном месте.

Начиная с середины 1990-х, пока я разбиралась со структурами молекул РНК с их уникальным биохимическим поведением, другие ученые спешили разработать новые системы, которые, подобно I-SceI, могли бы направленно действовать на конкретные последовательности ДНК. Тот, кому удалось бы решить эту проблему, смог бы раскрыть весь потенциал редактирования генома.

К этим технологиям нового поколения предъявлялось три критически важных требования: они должны были распознавать определенную выбранную последовательность ДНК; уметь разрезать эту последовательность и легко подвергаться перепрограммированию, для того чтобы атаковать различные последовательности ДНК и инициировать их разрыв. Первые два условия были необходимы для создания двуцепочечных разрывов, а третье – для того, чтобы этот инструмент был максимально универсален. I-SceI превосходно отвечала двум первым критериям, однако совершенно не соответствовала третьему. Биоинженеры поняли: чтобы создать программируемую систему разрезания ДНК, нужно либо перестроить I-SceI таким образом, чтобы она могла атаковать разные последовательности, либо найти совершенно новую нуклеазу, которая уже “научилась” разрезать самые различные последовательности ДНК.

Попытки ученых видоизменить I-SceI не достигли цели (что и неудивительно, учитывая крайне сложное молекулярное устройство белков-ферментов), и вскоре стало ясно, что поиск других природных нуклеаз – гораздо более перспективный подход. Фактически, к тому моменту, когда Джесин вела свои эксперименты с I-SceI, ученые уже выделили десятки нуклеаз из целого ряда организмов и установили конкретные последовательности ДНК, служившие мишенями для этих ферментов. Однако существовала фундаментальная проблема: подавляющее большинство ферментов распознавали последовательности длиной лишь в 6 или 8 “букв” – то есть слишком короткие для того, чтобы с таким ферментом можно было работать. В геноме человека подобные последовательности встречаются десятки или даже сотни тысяч раз, и это означает, что, даже если нуклеаза способна стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она в процессе может “порубить” почти весь геном. Клетка была бы разрушена еще до того, как у нее появится какой-либо шанс начать репарацию ДНК.

Исследователи не могли положиться ни на одну из ранее открытых нуклеаз, а поиск нового фермента, подобного I-SceI, для каждой новой попытки редактирования генома – задача совершенно неосуществимая. Если вы хотите превратить терапевтическое редактирование генома в эффективную технологию исправления болезнетворных мутаций, то медики не могут в каждом случае ждать, пока вы обнаружите нуклеазу, которая бы избирательно действовала именно на тот участок заданного гена, в котором у конкретного пациента вредоносная мутация. Вам необходима возможность “взять с полки” подходящую нуклеазу из уже открытых – или по крайней мере технология, позволяющая создавать нужные нуклеазы по мере необходимости.

Революционное исследование, предложившее решение этой проблемы, было проведено в 1996 году, хотя я тогда о нем не знала. Шринивасан Чандрасекаран, профессор из Университета Джонса Хопкинса, понял, что вместо создания нуклеаз “с нуля”, поиска новых в природе или переделывания I-SceI можно избрать смешанный подход: выбирать фрагменты существующих белков и комбинировать их. Такие химерные нуклеазы отвечали бы двум первым требованиям к редактирующей геном нуклеазе: они были бы способны распознавать определенную выбранную последовательность ДНК и делать в ней разрез.

Чандрасекаран решил собрать химерную нуклеазу из фрагментов двух встречающихся в природе белков, которые отлично справлялись с распознаванием и разрезанием последовательностей ДНК соответственно. Для разрезания Чандрасекаран выбрал участок бактериальной нуклеазы под названием FokI, который мог инициировать разрывы в ДНК, но не обладал предпочтениями к каким-либо последовательностям. А для “нацеливания” он приспособил повсеместно распространенные натуральные белки с цинковыми пальцами (ZFN), названные так потому, что они распознают ДНК, используя похожие на пальцы структуры, связанные ионами цинка и расположенные рядом друг с другом подобно пальцам на руке. Так как эти белки с цинковыми пальцами состоят из многократно повторяющихся, тандемно расположенных участков и каждый участок распознает определенную последовательность из трех “букв” ДНК, казалось вероятным, что ученые могут видоизменить эти белки, комбинируя фрагменты по-разному, чтобы они распознавали различные последовательности ДНК.

Удивительно, но химерная нуклеаза, судя по всему, сработала[36]. Соединив “режущий” фрагмент FokI с распознающим ДНК участком белка с цинковыми пальцами, команда Чандрасекарана продемонстрировала, что искусственно составленная нуклеаза распознавала и резала именно ту ДНК, что ожидали ученые, – даже несмотря на то, что они смешали два белковых компонента из совершенно различных источников.

Вскоре Чандрасекаран пригласил к сотрудничеству профессора университета Юты Дану Кэрролл, чтобы использовать эти новые нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) в более прикладных целях. Вместе они продемонстрировали, что ZFN работают и в яйцеклетках лягушки[37] (популярной среди биологов модельной системе) и что сделанные ZFN разрывы в ДНК стимулировали гомологичную рекомбинацию. Затем, работая с плодовыми мушками, сотрудники лаборатории Даны Кэрролл сумели запрограммировать новую ZFN на направленное воздействие на ген yellow (один из генов, определяющих окраску тела) и показали, что эта стратегия может обеспечить заданное генетическое изменение во всем организме[38]. Это был очень важный шаг в развитии редактирования генома. ZFN проявили себя не только подходящими для применения в организмах животных; что более важно, их оказалось можно видоизменить таким образом, чтобы их мишенями стали другие, новые гены.

Научное сообщество вскоре подхватило эстафету, и исследователи начали разрабатывать ZFN под собственные цели, выбирая в качестве мишеней новые гены и работая с новыми модельными объектами. В 2003 году Мэттью Портеус и Дэвид Балтимор первыми показали: ген в клетке человека можно редактировать с высокой точностью, используя специально созданную ZFN[39]. Вскоре после этого Федор Урнов и его коллеги исправили в клетках человека мутацию, вызывающую сцепленный с X-хромосомой ТКИД[40]. Возможности использования редактирования генома для направленного воздействия на наследственные заболевания еще никогда не казались настолько близкими к реальности.

Тем временем ZFN также начали использовать в лабораториях, которым редактирование генома было необходимо совсем для других целей – например, создания “дизайнерских” злаков или животных моделей. В конце 2000-х технологию успешно применили к резуховидке Таля, табаку и кукурузе, показав, что двуцепочечные разрывы ДНК способствуют высокоэффективной гомологичной рекомбинации во многих типах клеток, а не только в клетках млекопитающих. В это же время стали появляться публикации, в которых рассказывалось об использовании ZFN для изменения генов у пресноводных лучеперых рыб данио-рерио, червей, крыс и мышей. Это направление работы выглядело интригующе и неизменно привлекало мое внимание – и в научных статьях, и на конференциях. Его потенциал казался чрезвычайно мощным.

Однако, несмотря на свою кажущуюся перспективность, белки ZFN никогда не применялись широко за пределами небольшого числа лабораторий. Исследователи, использовавшие эти нуклеазы, либо сами обладали громадным опытом в области белковой инженерии, либо сотрудничали с теми немногими лабораториями, в которых подобные эксперименты уже проводились, либо могли позволить себе платить баснословные деньги за нуклеазы, сконструированные на заказ. В теории создание ZFN было простым: нужно было просто соединить различные фрагменты белков с цинковыми пальцами, чтобы они распознавали последовательность ДНК, которую исследователь желает отредактировать. Однако на практике это было очень сложно. Большая доля создаваемых ZFN попросту не распознавали те последовательности ДНК, которые должны были распознавать; другие были слишком неразборчивы и воздействовали на первые попавшиеся участки ДНК, лишь отдаленно похожие на целевые, и убивали клетки, геном которых должны были отредактировать. В других случаях фрагмент с цинковыми пальцами успешно распознавал ДНК, однако нуклеазный фрагмент не разрезал ее.

Подобно тому как изменение I-SceI оказалось слишком сложной задачей, так и ZFN тоже, как выяснилось, было нелегко перепрограммировать, чтобы использовать в качестве универсального инструмента редактирования генома. Конечно, результаты экспериментов с ZFN убедительно доказали, что специально видоизмененные нуклеазы полезны, если редактирование генома – самоцель, однако в этой области науки все еще нужна была новая технология, более надежная и простая в использовании.

Такая технология – или, по крайней мере, первая ее версия – была открыта в 2009 году при изучении новых типов белков, найденных в патогенных бактериях рода Xanthomonas, поражающих растения. Эти белки, которые были названы активатороподобными эффекторами транскрипции (transcription activator – like effectors, TALE), были удивительно похожи по своему строению на белки с цинковыми пальцами: они состоят из многократно повторяющихся фрагментов, и каждый фрагмент распознает определенную область ДНК. Однако от белков ZNF их отличала важная деталь: в то время как каждый “палец” в последних распознает трехбуквенную последовательность ДНК, каждый фрагмент TALE-белков узнает всего одну “букву” ДНК. Это различие позволило ученым легко определить закономерность, по которой фрагмент будет распознавать определенную “букву” ДНК, и затем они просто расположили эти фрагменты один за другим таким образом, чтобы они распознавали более длинную последовательность ДНК в гене. В случае ZFN это лишь казалось легко сделать, однако с TALE процедура в самом деле была простой.

Ученые быстро взялись за исследование новейшей “зацепки”. Вскоре после того, как был расшифрован этот код, три лаборатории соединили белки TALE с теми же режущими ДНК фрагментами, что есть в ZFN, и создали нуклеазы TALE, или TALEN. TALE-нуклеазы были очень эффективны для инициации редактирования генома внутри клеток, и после того как удалось еще несколько усовершенствовать их строение, стало очень похоже на то, что TALEN будет гораздо проще создавать и применять, чем ZFN.

“Но как жаль бедняжек TALEN”[41], – писала Дана Кэрролл в статье, описывающей историю появления редактирования генома. Потому что, как только TALEN обнаружили и адаптировали для редактирования, их вытеснило следующее, и возможно последнее, открытие в области редактирования генома. Эта технология получила название CRISPR, и здесь моя история соединяется с историей редактирования генома – и вообще с этим длинным маршем истории науки, которая в тот момент подошла к порогу новой головокружительной эры.